新型"进化引擎"研制出超级蛋白质，速度比天然进化快10万倍

"这就像给进化过程按下了快进键，"共同资深作者、斯克里普斯研究所总裁兼首席执行官皮特·舒尔茨表示，他同时担任L.S. '山姆'·斯卡格斯讲席教授。"现在可以在细胞内连续精确地进化蛋白质，既不会损伤细胞基因组，也无需繁琐的操作步骤。"

定向进化是一种实验室技术，通过多轮循环引入突变并筛选功能优化的变体。该技术用于定制具有所需特性的蛋白质，例如高选择性、高亲和力的抗体，具有新特异性或催化特性的酶，或用于研究药物靶标中耐药性突变的产生。然而，传统方法通常需要反复进行DNA操作和测试，每轮耗时一周或更久。连续进化系统——即蛋白质在活细胞内无需人工干预即可进化——旨在通过每轮细胞分裂（细菌约20分钟）实现同步突变和筛选来简化流程。但现有方法受限于技术复杂性或有限的突变率。

T7-ORACLE通过改造分子生物学标准模式生物大肠杆菌，规避了这些瓶颈。该系统在细菌内引入了一个源自T7噬菌体（一种感染细菌且因其简单高效的复制系统被广泛研究的病毒）的人工DNA复制系统。T7-ORACLE实现了生物大分子的连续超突变和加速进化，其设计具有广泛适用性，可应对多种蛋白质靶标和生物学挑战。从概念上讲，T7-ORACLE基于并扩展了现有正交复制系统（即独立于细胞自身机制运作的系统）的研究成果，例如酿酒酵母中的OrthoRep和大肠杆菌中的EcORep。与这些系统相比，T7-ORACLE兼具高突变率、快速生长、高转化效率的优势，且大肠杆菌宿主与环状复制子质粒均可轻松整合到标准分子生物学工作流程中。

T7-ORACLE正交系统仅靶向质粒DNA（小型环状遗传物质片段），对宿主细胞基因组毫无影响。通过将T7 DNA聚合酶（一种复制DNA的病毒酶）改造成易错形式，研究人员以比正常水平高10万倍的速率向靶基因引入突变，且不损伤宿主细胞。

"该系统代表了连续进化领域的重大突破，"共同资深作者、斯克里普斯研究所化学助理教授克里斯蒂安·迪克斯指出。"每周不再仅能进行一轮进化，而是细胞每次分裂都能完成一轮——这确实大大加速了进程。"

为验证T7-ORACLE的强大功能，研究团队将常见抗生素耐药基因TEM-1 β-内酰胺酶插入系统，并将大肠杆菌细胞暴露于浓度递增的多种抗生素中。不到一周时间，系统就进化出了能耐受比原始浓度高5,000倍抗生素的酶变体。这一概念验证不仅展示了T7-ORACLE的速度与精确性，还通过模拟抗生素治疗中耐药性产生的真实过程，证明了其现实意义。

"令人惊讶的是，我们观察到的突变与临床环境中发现的实际耐药突变高度吻合，"迪克斯强调。"某些情况下，我们发现了比临床现有组合更有效的新突变组合。"

但迪克斯强调该研究本身并不聚焦于抗生素耐药性。

"这并非一篇关于TEM-1 β-内酰胺酶的论文，"他解释道。"该基因仅是展示系统工作原理的表征完善的基准。关键在于我们现在可以在数天内进化几乎任何蛋白质，例如癌症药物靶点和治疗性酶，而非耗时数月。"

T7-ORACLE的广阔潜力在于其作为蛋白质工程平台的适应性。虽然系统构建于大肠杆菌内，但该细菌主要作为连续进化的载体。科学家可将人类、病毒或其他来源的基因插入质粒，再导入大肠杆菌细胞。T7-ORACLE会突变这些基因，产生可筛选或选择功能优化的变体蛋白质。由于大肠杆菌易于培养且实验室应用广泛，这为进化几乎任何目标蛋白质提供了便捷、可扩展的系统。

这将助力科学家更快地进化靶向特定癌症的抗体，开发更有效的治疗性酶，并设计靶向癌症和神经退行性疾病相关蛋白的蛋白酶。

"激动人心之处在于它不受限于单一疾病或蛋白质类型，"迪克斯表示。"系统具有可定制性，可插入任意基因并根据所需功能进行定向进化。"

此外，T7-ORACLE兼容标准大肠杆菌培养物和广泛使用的实验室流程，避免了其他连续进化系统所需的复杂操作方案。

"其核心优势在于实施的简易性，"迪克斯补充道。"无需专业设备或特殊技能。若已具备大肠杆菌操作经验，稍作调整即可使用本系统。"

T7-ORACLE体现了舒尔茨的宏观目标：重建DNA复制、RNA转录和蛋白质翻译等关键生物过程，使其独立于宿主细胞运作。这种分离使科学家能重新编程这些过程而不干扰正常细胞活动。通过将基础过程与基因组解耦，T7-ORACLE等工具推动了合成生物学的发展。

"未来我们计划利用此系统进化能复制完全非天然核酸的聚合酶：这些合成分子类似DNA和RNA，但具有新颖化学特性，"迪克斯阐述。"这将开启我们刚刚开始探索的合成基因组学新领域。"

目前，研究团队正致力于进化用于治疗的人类来源酶，并定制识别特定癌症相关蛋白序列的蛋白酶。

"T7-ORACLE方法融合了双重优势，"舒尔茨总结道。"我们现在能将理性蛋白质设计与连续进化相结合，以前所未有的效率发现功能分子。"

除迪克斯和舒尔茨外，研究论文《大肠杆菌中用于连续超突变和加速进化的正交T7复制体》的作者还包括斯克里普斯研究所的菲利普·松德曼、辛西娅·荣、托马斯·G·吉利斯、班亚慧、王赛琳和大卫·A·迪克。

本研究获得美国国立卫生研究院资助（项目号RGM145323A）。