CRISPR工具箱的新成员：教基因剪刀检测RNA

CRISPR-Cas系统是细菌的防御系统，已成为分子诊断技术的丰富来源。维尔茨堡亥姆霍兹RNA感染研究所（HIRI）的研究人员扩展了这一广泛的工具箱。他们的新方法称为PUMA，能够用天然靶向DNA的Cas12核酸酶检测RNA。PUMA承诺具有广泛的应用和高精度

该团队在《自然通讯》杂志上发表了研究结果

细菌已经发展出特殊的防御机制来保护自己免受病毒的侵害，病毒绝不只感染人类。作为这些所谓的CRISPR-Cas系统的一部分，CRISPR核糖核酸（crRNA）作为“引导RNA”，识别外源基因组的区域，如病毒DNA。CRISPR相关（Cas）核酸酶由crRNA引导，然后像剪刀一样切割它，使其无害

人类已经利用了这一策略：“CRISPR，通常被称为‘基因剪刀’，是许多分子技术的基础，”维尔茨堡亥姆霍兹基于RNA的感染研究所（HIRI）RNA合成生物学系主任Chase Beisel说。该研究所是布伦瑞克-亥姆霍兹感染研究中心（HZI）与维尔茨堡朱利叶斯·马克西米利安大学（JMU）合作的场所，Beisel在那里担任教授

2021年，Beisel实验室与JMU合作开发的诊断平台LEOPARD也利用CRISPR作为一种技术。LEOPARD有可能在一次测试中检测到各种与疾病相关的生物标志物。该方法基于重新编程RNA因子，即所谓的tracrRNAs。这些RNA自然参与帮助产生Cas9和不同Cas12核酸酶使用的指导RNA

“LEOPARD专注于Cas9。然而，CRISPR-Cas系统还包括另一组不同的核酸酶，称为Cas12，”Beisel解释道。虽然Cas9和Cas12都切割DNA靶点，但Cas12可以通过切割“侧支”DNA来增加输出信号。这可以使检测技术更敏感，因此更有效。Chase Beisel领导的团队现在将LEOPARD的独特功能扩展到Cas12。研究人员将由此产生的方法命名为PUMA（可编程追踪RNA解锁原间隔区邻近基序，通过Cas12核酸酶独立检测核糖核酸）

克服障碍

尽管Cas12核酸酶在分子诊断中得到了广泛的应用，但仍然存在两个主要局限性：基于Cas12的技术仅限于DNA靶点，需要一种称为PAM的特定识别序列来识别靶分子，PAM是原间隔区邻近基序的缩写

彪马优雅地应对了这些挑战。与LEOPARD一样，这种新方法也依赖于tracrRNAs

该研究的第一作者焦春雷解释说：“使用PUMA，我们可以对追踪RNA进行重新编程。这使我们能够决定哪种RNA生物标志物成为指导RNA。反过来，这种指导RNA将Cas12引导到我们提供的DNA分子上，并激活基因剪刀。”。焦春雷，前Beisel实验室的研究生和博士后研究员，也参与了LEOPARD的开发。他最近开始在新加坡国立大学担任教授

Beisel补充道：“DNA切割然后告诉我们样本中存在哪些生物标志物，例如不同病原体的特异性生物标志物。”

因此，这种新方法能够使用通常只能识别DNA的CRISPR核酸酶检测RNA生物标志物。Beisel说：“这对于只能在RNA水平上发现的分子生物标志物尤为重要。例如，这包括RNA病毒。”

然而，PUMA不需要特定的识别序列：PAM包含在提供的DNA靶分子中。由于研究人员提供了靶分子，他们还可以引入截短的DNA。因此，他们能够显著提高该方法的速度

Beisel总结道：“PUMA有可能成为一种灵活而精确的RNA检测工具。”

最后，研究小组通过鉴定与急性败血症相关的五种细菌病原体，证明了该方法的潜力。他们的检测依赖于一种通用的、重新编程的tracrRNA，它提供了一种简单的方法来区分各种类型的细菌。这在医学上开辟了广泛的潜在应用：

焦说：“这项新技术代表了一种新型的CRISPR诊断，可以在护理时进行可靠的分子检测，以识别病毒或细菌病原体或检测癌症生物标志物。”

研究小组已经在计划下一步：“我们的目标是实现类似于LEOPARD的多路读出，并扩大该技术的应用范围，”Beisel说，他还预计该技术将在研究界得到广泛应用。“我们希望我们的研究将促进对tracrRNA重编程的进一步探索。”