基因沉默工具需要速度：研究为RNAi工具设计提供了更深入的见解

RNA干扰（RNAi）是包括人类在内的许多生物体通过触发靶RNA降解或将其切成两半来降低细胞中靶RNA活性的过程。如果目标是信使RNA，即基因和蛋白质之间的中介，那么RNAi可以减少或完全沉默基因的表达

研究人员发现了如何定制RNAi以靶向不同的RNA，从那时起，它就被用作沉默感兴趣基因的研究工具。RNAi也被用于越来越多的治疗方法中，以沉默导致疾病的基因

然而，研究人员仍然不了解RNAi背后的一些生物化学。RNAi机制设计的微小差异可能导致其在降低基因表达方面的有效性存在很大差异

通过反复试验，研究人员已经制定了制造最有效的RNAi工具的指导方针，但并不确切了解它们为什么有效。

然而，怀特海研究所成员David Bartel和他的实验室研究生Peter Wang现在已经深入研究了RNAi所涉及的主要细胞机器的机制。研究人员的发现于7月17日在《分子细胞》杂志上分享，不仅为RNAi工具设计的一些已知规则提供了解释，还提供了可以改进未来设计的新见解

切片速度变化很大

执行RNAi的细胞机器有两个主要部分。一种是引导RNA，一种通常只有22个碱基或核苷酸长的微小RNA。RNA和DNA一样，由四种可能的碱基组成，尽管RNA的碱基是尿嘧啶（U）而不是DNA碱基胸腺嘧啶（T）

RNA碱基在某些配对中相互结合——鸟嘌呤（G）对胞嘧啶（C），腺嘌呤（A）对U——引导RNA中的碱基序列对应于靶RNA中的互补序列。

当引导RNA遇到靶时，相应的碱基配对，结合RNA。然后，RNAi机器的另一部分，即与引导RNA结合的Argonaute蛋白，可以将靶RNA切成两半，或触发细胞逐渐分解

在人类中，AGO2是最擅长切片的Argonaute蛋白质。实际上只有几十个RNA靶点被切片，但这些少数靶点在神经元信号控制和精确的身体形状形成等过程中起着至关重要的作用。切片对于RNAi工具和治疗方法也很重要

为了让AGO2对其目标进行切片，目标必须处于完全正确的位置。当引导RNA和靶RNA结合在一起时，它们会经历一系列运动，最终形成双螺旋。只有在这种配置下，AGO2才能对目标进行切片

研究人员假设AGO2以大致相同的速率切割不同的靶RNA，因为对这一过程的大多数研究都使用了相同的少数指导RNA。这些引导RNA恰好具有相似的特征，因此具有相似的切片动力学，但它们并不能代表大多数引导RNA

王将AGO2与更多种类的引导RNA配对，并测量了每个AGO2引导RNA复合物切割其靶标的速率。他发现了很大的差异。尽管常用的引导RNA的切割率可能相差2倍，但更大的引导RNA库相差高达250倍

切片速度通常比研究人员预期的要慢得多。此前，研究人员认为所有目标都可以相对快速地切片，因此速度不被视为限制因素——该过程的其他部分被认为决定了整体速度——但王发现切片有时可能是最慢的一步

王说：“重要的考虑因素是切片速度是比细胞中的其他过程快还是慢。”。“我们发现，对于许多指导RNA来说，切片率是限制因素。因此，它影响了疗效。”

AGO2切割靶点的速度越慢，更多的信使RNA将保持完整，转化为蛋白质，这意味着相应的基因将继续表达。研究人员观察到这一点：切割速度较慢的引导RNA比切割速度较快的RNA降低了靶基因的表达

微小的变化会导致切片率的巨大差异

接下来，研究人员探索了引导RNA之间切片率如此巨大差异的原因。他们突变了引导RNA，以沿着引导RNA的序列交换单个碱基——比如，将序列中的第10个碱基从C切换到a——并测量了这如何改变切片速率

研究人员发现，当位置7的碱基是A或U时，切片速率会增加。碱基A和U的配对比C和G更弱。研究人员发现在该位置有一个弱的A-U配对，或者在位置6或7有一个完全不匹配的配对，可能会在双螺旋形状中形成扭结，这实际上使目标更容易切片

王还发现，切片率随着第10和第17个碱基位置的某些替换而增加，尽管研究人员还无法确定可能的潜在机制

这些观察结果与RNAi设计的现有建议相对应，例如在位置7不使用G。这项新工作表明，这些建议之所以有效，是因为它们影响了切片速率，而且，在位置7的情况下，这项新研究进一步确定了起作用的具体机制

区域之间的相互作用很重要

设计合成导向RNA的人认为，位于第16位之后的末端碱基并不十分重要。这是因为在最常用的引导RNA的情况下，即使所有尾端位置都是无法配对的错配，靶标也会被快速切割

然而，王和巴特尔发现，尾端碱基的同一性仅在特定情况下无关紧要，而最常用的引导RNA恰好是这样的：当引导RNA中心（位置9-12）的碱基是强配对Cs和Gs时。

当中心配对较弱时，尾端碱基需要与靶RNA完美匹配。研究人员发现，基于其中心配对的强度，引导RNA对尾端错配的耐受性可能存在高达600倍的差异

这种差异的原因与两种RNA必须执行的最后一组运动有关，以便呈现其最终的双螺旋形状。完美配对的尾端使RNA更容易完成这些运动。然而，一个足够强的中心可以将RNA拉入双螺旋，即使尾端并不理想。

弱中心配对需要完美或接近完美的尾端匹配的观察结果可以为设计合成RNA提供一个有用的新指导。任何指导RNA有时都有可能结合与预期靶RNA足够相似的其他信使RNA。在治疗的情况下，这种脱靶结合可能会导致负面副作用

Bartel和Wang建议，研究人员可以设计具有弱中心的引导RNA，这需要在末端进行更完美的配对，这样引导RNA就不太可能与非靶RNA结合；只有靶标RNA序列的完美配对就足够了

总之，王和Bartel的研究结果解释了指导RNA之间的微小差异如何使RNAi的疗效产生如此大的差异，为长期存在的RNAi设计指南提供了理论基础。一些发现甚至提出了新的指导方针，可以帮助未来的合成指导RNA设计

Bartel说：“发现引导RNA的中心和尾端之间的相互作用是出乎意料和令人满意的。”Bartel也是麻省理工学院的教授和霍华德·休斯医学研究员

“这解释了为什么尽管指南建议尾端序列无关紧要，但我们细胞中切割的靶RNA确实与尾端配对。这一观察结果可能有助于减少RNAi治疗中的脱靶效应。”