单细胞ACE蛋白检测

自20世纪50年代以来，研究人员使用Wallace Coulter发明的一种著名的方法，即“流式细胞术”，在研究和人类血液样本中表征不同类型的免疫细胞。这使得我们能够更深入地了解免疫细胞的发育，以及评估人类健康和诊断各种血癌的新方法。后来，流式细胞术也被应用于其他细胞类型

在传统的流式细胞术中，细胞表面和细胞内蛋白质是用与荧光探针连接的抗体分子检测的。然而，在提供单细胞灵敏度的同时，这种方法在检测多种蛋白质方面受到荧光团数量的限制，这些荧光团可以在整个荧光光谱中清楚地区分

2009年“质量细胞术”的出现允许同时定量单个细胞中的50种蛋白质，并对细胞的身份和生理状态进行更精细的分析。在质谱仪中，抗体与金属元素的非放射性同位素有关。这些同位素可以根据其质量在质谱仪的不同通道中进行定量。

然而，与流式细胞术和荧光显微镜相比，质谱仪及其表亲“图像质谱仪”（IMC）用于在完整组织切片中可视化细胞蛋白，其代价是灵敏度降低

现在，又过了15年，哈佛大学威斯研究所领导的一项研究合作，包括麻省理工学院和多伦多大学的研究人员，开发了一种使用DNA纳米技术显著提高质量细胞术和IMC灵敏度的方法。将一种名为“环延伸扩增”（ACE）的新信号放大技术应用于与抗体连接的DNA条形码，他们能够将抗体结合的金属同位素产生的蛋白质信号放大500倍以上，并同时以高灵敏度检测30多种不同的蛋白质

新方法使他们能够定量检测稀有蛋白质，研究复杂的生物组织变化，并研究调节免疫细胞功能的相互连接的蛋白质的整个网络如何对刺激和病理条件做出反应。应用于IMC，ACE还可以鉴定组织切片中的细胞类型和组织区室，以及与多囊肾病病理相关的组织组织变化

研究结果发表在《自然生物技术》上

领导该研究的Wyss研究所核心教员彭寅博士说：“ACE有助于缩小细胞术分析中的一个关键差距：通过提高质量细胞术的灵敏度，它实现了一个同时实现高灵敏度、高多路复用和高通量的单细胞分析平台。它为用高度多路复用和敏感的方法研究悬浮和完整组织中的单细胞开辟了机会，可以更深入地了解正常和病理生物过程。”。尹也是哈佛医学院（HMS）系统生物学系的教授

更多的DNA，更多的金属同位素，更高的灵敏度

此前，Yin和他在Wyss研究所的团队开发了多种基于DNA的成像技术，可以在单分子水平上以超高分辨率揭示细胞的内部运作，或者通过在单个组织切片中可视化许多不同的RNA和蛋白质分子。但是，使用这些方法创建的DNA结构没有足够的弹性来承受质谱仪中使用的相对恶劣的条件

“与传统的质量细胞术相比，ACE允许研究人员将抗体分子与大量增加的金属同位素联系起来，从而解决了当前质量细胞术的敏感性问题。这大大促进了广泛的低丰度蛋白质的定量，这在以前的单细胞方法中一直是具有挑战性的，”尹团队的博士后研究员、共同第一作者肖康伦博士说。Lun与共同第一作者Kuanwei Sheng博士合作开展了该项目，Kuanwei Seng博士最初为其他应用开发了ACE，包括多路成像，他也是Yin的博士后研究员

Sheng说：“受我们之前在引物延伸反应（Primer Extension Reaction）方面的工作的启发，我们创造了线性DNA结合物（串联连接的同一DNA序列的多个拷贝），以及通过同步热循环实现扩增的PCR反应，我们发明了ACE，通过可控的热循环在原位合成线性结合物。”

ACE为携带短金属同位素的“检测链”创建了一个具有多个结合位点的支架。此外，通过分支支架链的合成，研究人员可以进一步提高该方法检测稀有蛋白质的灵敏度。线性ACE平均提供13倍的信号放大，而分支ACE允许最初未放大的信号增加500倍以上

为了稳定整个ACE序列复合物并在质谱分析过程中保持其完整性，他们用化学交联剂交联了支架和添加的检测器链之间形成的短双链

“按照这个配方，我们设计了一个包含33个可区分的（直系同源）ACE序列的面板，它们的合成不会相互干扰，并将其应用于三种完全不同类型的分析，”盛说，他也是尹团队的博士后研究员

ACE在起作用

该团队首先使用ACE来研究上皮细胞向间充质细胞的转变，并再次转变为上皮细胞。上皮间充质转化（EMTs）和间充质上皮转化（METs）发生在胚胎发育过程中，但当肿瘤变得侵袭性和转移性时，前者也会重新发生

通过在单个小鼠乳腺癌症细胞从上皮状态转变为间充质状态并返回的28天内多次分析其总共32个上皮和间充质标志物、信号分子和罕见转录因子，并通过计算分析结果，他们能够对这两个过程提供新的线索

Sheng说：“ACE使我们能够同时分析低丰度转录因子的水平，以及反映单细胞中细胞生理和信号状态的标记。这为EMT和MET中的分子程序如何由关键转录因子（包括Zeb-1和Snail/Slug）的增加和减少所驱动提供了更精细的图景。”

在他们的第二个例子中，他们放大了单个T细胞的内部运作。T细胞受体（TCR）分子在其表面的刺激导致细胞内信号蛋白复杂网络的激活。由于T细胞体积小，以单细胞分辨率分析这些信号反应一直很困难。该网络的单个蛋白质被磷酸残基激活，磷酸残基由通常称为激酶的其他网络蛋白质连接到它们上

这些活化的网络蛋白中的许多继续磷酸化网络中的其他蛋白。这最终导致T细胞行为的改变，例如，对病原体或癌症细胞。研究人员将ACE应用于30种抗体，这些抗体特异性结合TCR网络蛋白中的磷酸化基序，在应激、炎症、细胞增殖和其他反应中发挥作用

Lun说：“使用ACE增强的质量细胞术分析，我们捕获了单个原代人类T细胞中动态变化的TCR网络的定量快照。这使我们能够研究特定T细胞激活事件的时间和持续时间的单细胞变化，并揭示该网络是如何通过细胞外线索从基态激活的。”

该团队使用相同的ACE增强抗体小组来研究一种称为“损伤诱导的T细胞麻痹”的现象。在环境中受到损伤的T细胞，如重大手术中造成的组织损伤，通常会变得免疫抑制

为了开始了解TCR网络是如何导致这种情况的，Yin的团队与合著者Michael Yaffe，医学博士，博士合作，他是麻省理工学院的David H.Koch科学教授和生物学与生物工程教授，对组织损伤部位周围的微环境如何抑制免疫系统非常感兴趣。Yaffe向研究小组提供了从接受手术的患者身上获得的“术后引流液”（POF）样本。用POF及其TCR刺激T细胞使研究人员能够分离出导致单个T细胞停止分裂并耗尽的不同网络变化

最后，他们通过关注人类肾脏，研究了ACE在使用IMC对组织切片中的蛋白质进行空间分析方面的实用性。肾组织因其强烈的自发荧光而难以通过荧光显微镜进行分析，而传统的IMC因其缺乏灵敏度而难以进行分析

研究人员开发了一个由20种ACE增强抗体组成的小组，用于检测各种肾脏标志物，并用它来检查多囊肾病患者的肾皮质切片。在这种方法中，他们与合著者、加拿大多伦多大学教授、多路成像专家Hartland Jackson博士合作，使他们能够识别肾脏近端和远端小管、收集管和血液过滤肾小球内的不同细胞类型及其组织

Lun说：“我们发现了细胞和组织组织的新的疾病特异性特征，并发现与肾脏疾病相关的干细胞标志物巢蛋白在肾小球中的表达非常异质。”。“这可能意味着组织的不同部分可能同时经历不同的病理阶段。”

“彭寅团队及其合作者开发的这种新的质谱仪方法再次展示了利用DNA纳米技术来增强与临床护理高度相关的现有技术的力量，并使其达到更高的灵敏度和特异性水平。这种相对简单的方法将为健康和疾病期间的细胞、组织和器官功能带来全新的见解，”Wyss创始董事Donald Ingber博士说，他的团队在刺激T细胞方面提供了关键的专业知识。他也是HMS和波士顿儿童医院血管生物学的Judah Folkman教授，以及哈佛大学约翰·A·保尔森工程与应用科学学院的Hansjörg Wyss生物启发工程教授

该研究的其他作者有余雪阳、林清扬、高库尔、马修·塞拉塔、翟云浩、苏汉泉、栾敬怡和金永恩 More information: Xiao-Kang Lun et al, Signal amplification by cyclic extension enables high-sensitivity single-cell mass cytometry, Nature Biotechnology (2024). DOI: 10.1038/s41587-024-02316-x

Journal information: Nature Biotechnology