全新“进化引擎”技术使蛋白质进化速度提升十万倍

"这就像给进化按下了快进按钮，" 共同资深作者、斯克里普斯研究所总裁兼首席执行官皮特·舒尔茨说，他同时担任 L.S. 'Sam' Skaggs 特聘主席。"现在可以在细胞内持续、精确地进化蛋白质，而不会损伤细胞基因组或需要繁琐的步骤。"

定向进化是一种实验室过程，涉及引入突变并在多个周期中选择具有改进功能的变体。它用于定制具有所需特性的蛋白质，例如高选择性、高亲和力的抗体，具有新特异性或催化特性的酶，或用于研究药物靶标中耐药性突变的出现。然而，传统方法通常需要重复进行 DNA 操作和测试，每轮耗时一周或更久。连续进化系统——蛋白质在活细胞内无需人工干预即可进化——旨在通过使突变和选择在每轮细胞分裂时（细菌约20分钟）同步进行来简化这一过程。但现有方法受限于技术复杂性或有限的突变率。

T7-ORACLE 通过改造大肠杆菌（分子生物学中的标准模式生物）来规避这些瓶颈，使其承载一个源自噬菌体 T7 的第二套人工 DNA 复制系统。T7 是一种感染细菌的病毒，因其简单高效的复制系统而被广泛研究。T7-ORACLE 可实现生物大分子的持续超突变和加速进化，并被设计为广泛适用于多种蛋白质靶标和生物学挑战。从概念上讲，T7-ORACLE 基于并扩展了现有正交复制系统（意指它们独立于细胞自身的机制运作）的工作，例如酿酒酵母（面包酵母）中的 OrthoRep 和大肠杆菌中的 EcORep。与这些系统相比，T7-ORACLE 的优势在于结合了高诱变率、快速生长、高转化效率，以及大肠杆菌宿主和环状复制子质粒易于融入标准分子生物学工作流程的特点。

T7-ORACLE 正交系统仅靶向质粒 DNA（小的环状遗传物质片段），而不触及细胞的宿主基因组。通过将 T7 DNA 聚合酶（一种复制 DNA 的病毒酶）改造为易出错型，研究人员以比正常高 100,000 倍的速率将突变引入目标基因，且不损伤宿主细胞。

"这个系统代表了连续进化的重大进步，" 共同资深作者、斯克里普斯研究所化学助理教授克里斯蒂安·迪尔克斯说。"不再是每周一轮进化，而是细胞每次分裂时就进行一轮——因此它真正加速了这个过程。"

为展示 T7-ORACLE 的强大能力，研究团队将一种常见的抗生素抗性基因 TEM-1 β-内酰胺酶插入该系统，并将大肠杆菌细胞暴露于不同抗生素的递增剂量下。在不到一周的时间内，该系统进化出的酶变体可抵抗高达原始水平 5000 倍的抗生素浓度。这一概念验证不仅证明了 T7-ORACLE 的速度和精确度，还通过复制抗生素作用下耐药性如何发展，证明了其现实意义。

"令人惊讶的是，我们观察到的突变与临床环境中发现的实际耐药性突变高度吻合，" 迪尔克斯指出。"在某些情况下，我们看到了比临床中发现的效果更好的新组合突变。"

但迪尔克斯强调，该研究本身并非聚焦于抗生素耐药性。

"这不是一篇关于 TEM-1 β-内酰胺酶的论文，" 他解释道。"该基因只是一个经过充分表征的基准，用以展示系统如何运作。重要的是，我们现在可以在几天而非几个月内进化几乎任何蛋白质，比如癌症药物靶点和治疗性酶。"

T7-ORACLE 更广泛的潜力在于其作为蛋白质工程平台的适应性。尽管该系统构建于大肠杆菌内，但该细菌主要用作连续进化的容器。科学家可以将来自人类、病毒或其他来源的基因插入质粒，然后将其导入大肠杆菌细胞。T7-ORACLE 使这些基因发生突变，产生可被筛选或选择以改进功能的变体蛋白质。由于大肠杆菌易于培养且在实验室中广泛应用，它为进化几乎任何目标蛋白质提供了一个方便、可扩展的系统。

这可以帮助科学家更快地进化抗体以靶向特定癌症，进化更有效的治疗性酶，并设计靶向涉及癌症和神经退行性疾病蛋白质的蛋白酶。

"令人兴奋的是，它不限于一种疾病或一类蛋白质，" 迪尔克斯说。"因为该系统是可定制的，你可以放入任何基因，并根据你需要实现的功能来进化它。"

此外，T7-ORACLE 与标准大肠杆菌培养物和广泛使用的实验室工作流程兼容，避免了其他连续进化系统所需的复杂操作流程。

"使其与众不同的主要特点是实施的简易性，" 迪尔克斯补充道。"不需要特殊设备或专业知识。如果你已经在使用大肠杆菌，那么你可能只需极少调整即可使用该系统。"

T7-ORACLE 反映了舒尔茨更宏大的目标：重建关键的生物过程——如 DNA 复制、RNA 转录和蛋白质翻译——使它们独立于宿主细胞运作。这种分离使科学家能够重新编程这些过程而不干扰正常的细胞活动。通过将基本过程与基因组解耦，像 T7-ORACLE 这样的工具有助于推进合成生物学。

"未来，我们有兴趣使用这个系统来进化能够复制完全非天然核酸的聚合酶：这些合成分子类似于 DNA 和 RNA，但具有新颖的化学特性，" 迪尔克斯说。"这将开启我们才刚刚开始探索的合成基因组学可能性。"

目前，研究团队专注于进化人源酶用于治疗，以及定制蛋白酶以识别特定的癌症相关蛋白序列。

"T7-ORACLE 方法融合了两者的优势，" 舒尔茨说。"我们现在可以将合理的蛋白质设计与连续进化相结合，比以往更有效地发现功能分子。"

除了迪尔克斯和舒尔茨，该研究《用于大肠杆菌中持续超突变和加速进化的正交 T7 复制体》的作者还包括斯克里普斯研究所的 Philipp Sondermann、Cynthia Rong、Thomas G. Gillis、Yahui Ban、Celine Wang 和 David A. Dik。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（资助号 RGM145323A）的资助。