Cas9祖先被改造成一种紧凑的基因组编辑工具

麦戈文研究所、麻省理工学院博德研究所和哈佛大学的科学家们将他们在细菌中发现的一种紧凑的RNA引导酶重新设计成一种高效的、可编程的人类DNA编辑器。这种被称为NovaIscB的工程蛋白可以适应对遗传密码的精确改变，调节特定基因的活性，或执行其他编辑任务。由于其小尺寸简化了向细胞的递送，NovaIscB的开发人员表示，它是开发治疗或预防疾病的基因疗法的有前景的候选者。

这项研究由麦戈文研究所研究员和博德研究所核心成员张峰领导，张峰也是麻省理工学院的James和Patricia Poitras神经科学教授，也是霍华德休斯医学研究所的研究员。张和他的团队在《自然生物技术》杂志上报道了他们的工作。

NovaIscB来源于一种细菌DNA切割器，该切割器属于张的实验室于2021年发现的IscBs蛋白质家族。IscBs是OMEGA系统的一种，是Cas9的进化祖先，Cas9是细菌CRISPR系统的一部分，张和其他人已经将其发展成为强大的基因组编辑工具。与Cas9一样，IscB酶在RNA指南指定的位点切割DNA。通过重新编程该指南，研究人员可以将酶重定向到他们选择的靶序列。

IscBs引起了研究小组的注意，不仅因为它们具有CRISPR DNA切割Cas9的关键特征，还因为它们的大小是其的三分之一。这对潜在的基因疗法来说是一个优势：紧凑型工具更容易传递到细胞中，使用小型酶，研究人员将有更大的灵活性进行修补，可能会添加新的功能，而不会创建过于笨重的工具用于临床。

从他们对IscBs的初步研究中，张实验室的研究人员知道，该家族的一些成员可以切割人类细胞中的DNA靶标。然而，没有一种细菌蛋白的作用足够好，可以用于治疗。该团队将不得不修改IscB，以确保它可以有效地编辑人类细胞中的靶标，而不会干扰基因组的其他部分。

为了开始这一工程过程，张实验室的研究生Soumya Kannan现在是哈佛大学研究员协会的初级研究员，也是博士后研究员Shiyou Zhu首先寻找了一个可以作为良好起点的IscB。他们测试了细菌中近400种不同的IscB酶。其中10种能够编辑人类细胞中的DNA。

即使是其中最活跃的，也需要进行增强，使其成为一种有用的基因组编辑工具。挑战在于提高酶的活性，但仅限于其RNA指南指定的序列。如果这种酶变得更活跃，但不加选择地变得更活跃了，它就会在意想不到的地方切割DNA。朱解释说：“关键是同时平衡活性和特异性的提高。”。

朱指出，细菌IscBs是通过相对较短的RNA向导指向其靶序列的，这使得很难将酶的活性限制在基因组的特定部分。如果IscB可以被设计为容纳更长的引导，它就不太可能作用于超出其预期目标的序列。

为了优化人类基因组编辑的IscB，该团队利用了研究生Han Altae Tran的信息，他现在是华盛顿大学的博士后研究员，了解了细菌IscB的多样性以及它们是如何进化的。例如，研究人员指出，在人类细胞中起作用的IscBs包括一个他们称之为REC的片段，这在其他IscBs中是不存在的。

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他们怀疑酶可能需要该片段与人类细胞中的DNA相互作用。当他们仔细研究该区域时，结构建模表明，通过略微扩展蛋白质的一部分，REC也可能使IscBs能够识别更长的RNA引导。

基于这些观察结果，研究小组尝试了交换来自不同IscBs和Cas9的REC结构域的一部分，评估了每种变化如何影响蛋白质的功能。在他们对IscBs和Cas9s如何与DNA及其RNA向导相互作用的理解的指导下，研究人员做出了额外的改变，旨在优化效率和特异性。

最后，他们产生了一种名为NovaIscB的蛋白质，该蛋白质在人类细胞中的活性比他们开始使用的IscB高100多倍，并且对其靶标具有良好的特异性。

Kannan和Zhu在到达NovaIscB之前构建并筛选了数百个新的IscB，他们对原始蛋白质所做的每一个改变都是战略性的。他们的努力是基于他们的团队对IscBs自然进化的了解，以及使用名为AlphaFold2的人工智能工具对每种改变如何影响蛋白质结构的预测。

与将随机变化引入蛋白质并筛选其影响的传统方法相比，这种合理的工程方法大大加快了团队识别具有他们所寻找特征的蛋白质的能力。

研究小组证明，NovaIscB是各种基因组编辑工具的良好支架。“它的生化功能与Cas9非常相似，这使得它很容易移植到已经用Cas9支架优化的工具上，”Kannan说。通过不同的修改，研究人员使用NovaIscB替换人类细胞中DNA编码的特定字母，并改变靶基因的活性。

重要的是，基于NovaIscB的工具足够紧凑，可以很容易地包装在单个腺相关病毒（AAV）中，AAV是最常用于安全地向患者提供基因治疗的载体。因为它们体积更大，使用Cas9开发的工具可能需要更复杂的交付策略。

张的团队开发了一种名为OMEGAoff的工具，将化学标记添加到DNA中以降低特定基因的活性，从而证明了NovaIscB的治疗潜力。他们对OMEGAoff进行编程，以抑制参与胆固醇调节的基因，然后使用AAV将该系统输送到小鼠的肝脏，从而使动物血液中的胆固醇水平持续降低。

该团队预计，NovaIscB可用于将基因组编辑工具靶向大多数人类基因，并期待看到其他实验室如何部署这项新技术。他们还希望其他人能够采用他们的进化指导方法进行合理的蛋白质工程。朱说：“大自然有如此多样性，它的系统有不同的优缺点。”。“通过了解这种自然多样性，我们可以使我们试图设计的系统越来越好。”