现在，加州大学伯克利分校的物理学家已将这一相同原理引入电子显微镜技术中，该技术能够将物体放大约比传统光学显微镜大10,000倍。
研究人员开发了一种称为激光相板的设备，可显著改善冷冻电子显微镜。在过去十年中，这种强大的成像方法彻底改变了蛋白质结构的研究，并帮助加速了药物发现。尽管如此，它仍存在一个主要局限性：大多数人类蛋白质太小，获取其JianCe图像仍然极其困难。
这项新的激光技术可以帮助克服这一障碍，有可能使科学家能够对小至当前显微镜所面临挑战的蛋白质三分之一大小的蛋白质进行成像。
更大的影响可能来自于对冷冻电子断层扫描的改进。这种较新的方法结合从多个角度捕获的图像，构建蛋白质和其他分子的三维视图。与在溶液中研究孤立分子的技术不同，冷冻电子断层扫描可以揭示蛋白质在其天然细胞环境中的排列和相互作用方式。
“冷冻电子显微镜已成为解析生物大分子结构的新兴且发展最快的方法，而冷冻电子断层扫描有望展示这些分子在其天然细胞环境中的协同工作方式，”领导这项开发工作的加州大学伯克利分校物理学教授兼劳伦斯伯克利国家实验室科学家霍尔格·穆勒说。“但由于信噪比的限制，大多数人类和动物蛋白质太小，无法通过这些方法进行分析。这种激光相板带来的信噪比提升有望克服这些重要限制。”
非凡的激光揭示隐藏的细胞结构
这一突破依赖于研究人员所描述的世界上强度最高的聚焦连续波激光。该激光并非简单地照亮样本，而是直接与显微镜的电子束相互作用，改变其相位以增加图像对比度。
这种调整使得区分小分子（包括血红蛋白）与其周围环境变得更加容易。它还可以提高细胞内部结构（如细胞核和线粒体）的可见度。
“利用冷冻电子断层扫描，我们观察的是体积小且极其复杂的细胞物质，细胞内部非常拥挤，”位于加利福尼亚州红木城Biohub的创始成像技术总监布里奇特·卡拉格说。“这就像一片森林，你试图在其中一棵树上找到一片叶子。冷冻电子断层扫描在对比度方面需要迈出重大的一步，这样我们才能开始看到细胞内部发生了什么。这就是激光相板有望为我们提供的。”
在Biohub的资金支持下，穆勒获得了一台先进的冷冻电子显微镜仪器，并为其配备了新型激光相板。他将由此产生的显微镜命名为Theia，取自古希腊与光和光辉相关的泰坦女神之名。
与此同时，卡拉格正在指导Biohub位于红木城的成像设施中建造一台相关的显微镜。她的团队仪器使用两束激光而不是一束，建立在穆勒及其合作者进行的理论研究基础之上。
这两束激光以直角排列，每束以大约一半的功率运行。这种配置有助于防止组件烧毁，同时也减少了可能干扰图像质量的光学畸变。
两个研究团队都在与冷冻电子显微镜仪器的领先制造商赛默飞世尔科技合作。
“Theia是一级方程式显微镜，”穆勒说。“它配备了额外的电子光学系统，即使没有激光，其分辨率也优于标准冷冻电子显微镜。加上激光相板后，我们希望它真正成为世界上总体最好的仪器。”
伯克利团队的最新图像和技术发现发表在《科学》杂志上。Biohub双激光设计的详细信息可在最近发布的预印本中找到。
诺贝尔奖获奖发现如何改变显微镜技术
要理解这项新技术为何重要，回顾一下生物成像中长期存在的挑战会有所帮助。
由于植物和动物细胞主要由水组成，在普通光学显微镜下观察时它们相对透明。虽然这种透明度看似有益，但它却带来了一个问题。包括线粒体和细胞核在内的小型细胞结构散射的光极少，因此仅比周围物质显得略暗。
传统上，科学家通过添加染色剂来创造更大对比度以解决这个问题。然而，染色也会杀死细胞。
1930年，荷兰物理学家弗里茨·泽尔尼克意识到，穿过生物材料的光在变化方式上不仅仅是变亮或变暗。当光在细胞内散射时，它也会经历一个微小的延迟，从而改变其相位，即波峰的时序。
尽管人眼无法直接检测到这种相移，泽尔尼克发现它可以转化为可见的亮度差异。通过将未散射光的相位移动90度，当光到达观察者眼中时，他使细微的细胞特征在其背景中更加JianCe地凸显出来。
这一创新成为相衬显微镜的基础，为泽尔尼克赢得了1953年诺贝尔物理学奖。
到20世纪40年代初，科学家已经认识到相衬在研究细胞方面的巨大作用。他们开始探索同样的想法是否可以改善电子显微镜，这种显微镜使用电子而不是光来检查小至单个蛋白质的结构。
不幸的是，早期的尝试遇到了严重的技术困难。旨在改变电子束相位的设备通常会过度削弱电子束，引入图像不稳定性，或降低分辨率。
2010年出现了一种可能的解决方案，当时穆勒和现任加州大学伯克利分校分子与细胞生物学名誉教授的罗伯特·格拉瑟提出使用强激光产生必要的相移。他们的方法提供了一种在不牺牲电子束强度的情况下提高对比度的途径。
克服电子显微镜的局限性
格拉瑟在开发冷冻电子显微镜方面发挥了重要作用，与传统的X射线晶体学相比，它提供了一种潜在更简单的确定分子结构的方法。
X射线晶体学要求研究人员培养他们想要研究的分子晶体，并获得强大的X射线源的使用权。冷冻电子显微镜避免了结晶分子的需要，但它自身也存在困难。
最大的问题之一是电子束会加热并最终损坏被检查的样本。这限制了可以收集的信息量以及所得图像的详细程度。用金属覆盖样本可以减少损坏并提高对比度，但也会使图像不够JianCe。
在20世纪60年代期间，研究人员开始研究冷冻生物样本是否可以保护它们免受辐射损伤。
格拉瑟证明冷却样本有助于在成像过程中保存它们。他还提议使用强度较低的电子束一次检查数千个冷冻分子，从而进一步限制损伤。
由于这些分子会以不同角度定位，计算机可以分析并组合它们的图像，以重建高度详细的分子结构。
这些进展帮助奠定了现代冷冻电子显微镜的基础，其开发者获得了2017年诺贝尔化学奖。在获奖感言中，诺贝尔奖得主对格拉瑟的贡献表示了感谢。
诺贝尔委员会赞扬了这项技术，解释说冷冻电子显微镜“既简化又改进了生物分子的成像。这种方法已将生物化学带入一个新时代。”
驾驭异常强大激光的15年探索
将激光相板概念转化为实用技术需要多年的工程开发。
在2010年提出建议后，穆勒花了15年时间追求这一想法，其中部分研究得到了美国国立卫生研究院的支持。
第一个主要挑战是产生一种集中在微小区域内的异常强烈的激光束。研究人员需要足够的光强度将电子束的相位改变90度。
开发必要的系统花了十年时间。
他们的解决方案是将连续激光束限制在衬有镜子的球形腔体内。随着光在腔内反复反射超过10,000次，其强度急剧增加，同时光束被聚焦成一个极小的光斑。
“这是75千瓦的功率聚焦到几微米，”穆勒说。“这比你用于焊接的功率还要大。比军用激光器的功率还大。它积累了有史以来最亮的连续激光焦点。”
该团队首先通过在格拉瑟的一台旧电子显微镜中安装激光相板，证明了该概念是可行的。
Biohub的额外资金使其有可能获得一台定制的、最先进的赛默飞世尔Krios冷冻电子显微镜，并对其进行改造以适应激光技术。
在他们的最新研究中，科学家们使用六种大小和制备方法各异的样本对升级后的显微镜进行了测试。激光持续改善了图像分辨率，对于使用标准方法难以成像的样本，改善尤为显著。
“对于最具挑战性的情况——小颗粒、劣质样本——激光产生了非常可观的优势，”穆勒说。
曾经因太小而无法研究的蛋白质现获更JianCe图像
为了展示新显微镜的能力，研究人员重建了两种不同蛋白质的图像。
第一种是醛缩酶，这是一种存在于肌肉中的蛋白质，现代冷冻电子显微镜系统已经能够相对容易地对其成像。第二种是血红蛋白，即负责在血液中输送氧气的蛋白质。
血红蛋白要小得多，接近传统冷冻电子显微镜仪器能够可靠分析的蛋白质尺寸下限。
使用激光相板，研究人员提高了这两种蛋白质结构的分辨率。对于血红蛋白，改善尤为显著，突显了该技术克服与小分子相关困难的潜力。
“归根结底，如果你有一个大蛋白质和一个非常好的样本——例如，新鲜的或冷冻时没有气泡的——你可能不需要相板就能获得单张高质量图像。但对于小蛋白质和糟糕的样本，开启激光是最好的，”穆勒说。“这可能填补我们对那些无法结晶或对当今冷冻电子显微镜而言太小的蛋白质结构认知上的巨大空白。而且它对冷冻电子断层扫描将是革命性的。”
蛋白质质量通常以道尔顿表示，该单位以英国化学家约翰·道尔顿的名字命名。一道尔顿定义为碳-12原子质量的十二分之一。
传统冷冻电子显微镜难以对小于约70千道尔顿的蛋白质进行成像。这一局限性尤为重大，因为低于此阈值的蛋白质约占人类蛋白质组的90%，即人体产生的全部蛋白质集合。
借助激光相板，研究人员现在可以对小至50千道尔顿的蛋白质进行成像，尽管这样做仍然具有挑战性。此类蛋白质甚至比血红蛋白还要小。
下一个目标是揭示更小的蛋白质
穆勒相信，该技术最终可能使科学家能够研究小至17千道尔顿的蛋白质（肌红蛋白的大小）。
实现这一目标可能需要另一项改进：使用紧密聚焦的电子束，而不是目前在没有激光相板的情况下为产生足够对比度所需的散焦电子束。
据穆勒称，激光系统应该使得直接从聚焦电子束的相位变化中获得对比度成为可能。
如果成功，这种调整可能使对比度和信噪比再次翻倍，这是在激光相板已取得的改进基础上的进一步提升。
这样的进展可能使研究人体中更大比例的蛋白质成为可能，并为了解它们在细胞复杂环境中的相互作用提供前所未有的洞察力。
“这项技术对生物学来说是一个阶跃函数式的变革，”Biohub成像科学副总裁斯蒂芬妮·奥特说。“我们将首次能够在活细胞内部、在自然背景下观察分子机器是如何运作的。曾经不可见的事物将变得可见——这将改变我们对疾病的理解的一切。”
伯克利研究团队还包括格拉瑟；博士后研究员兼共同第一作者彼得·彼得罗夫和杰西·张； staff scientist 乔纳森·雷米斯；博士后研究员程航；以及现任和前任物理学研究生杰里米·阿克塞尔罗德、埃里克·库珀、伊恩·希克林、沙哈尔·桑德豪斯和库珀·施努尔。
在Biohub，卡拉格和该组织创始成像科学主任大卫·阿加德共同领导动态结构细胞生物学小组。两人都是Biohub预印本的共同通讯作者，Biohub工程师帕维尔·奥尔辛也位列其中。