新型"进化引擎"以10万倍速度研制超级蛋白质

“这就像赋予了进化过程一个快进按钮，”共同资深作者、斯克里普斯研究所总裁兼首席执行官皮特·舒尔茨（Pete Schultz）说道，他同时持有 L.S. "Sam" Skaggs 讲席教授职位。“现在可以在细胞内连续、精确地进化蛋白质，而不会损伤细胞的基因组，也无需繁琐的人工操作步骤。”

定向进化是一种实验室过程，涉及引入突变并在多个周期中筛选功能改进的变体。它被用于定制具有所需特性的蛋白质，例如高选择性、高亲和力的抗体，具有新特异性或催化特性的酶，或用于研究药物靶点中耐药性突变的产生。然而，传统方法通常需要反复进行 DNA 操作和测试，每轮耗时一周或更久。连续进化系统——即在活细胞内无需人工干预实现蛋白质进化——旨在通过使突变和筛选在每个细胞分裂轮次中（细菌约20分钟）同时进行来简化此过程。但现有方法受限于技术复杂性或有限的突变率。

T7-ORACLE通过改造大肠杆菌（E. coli）——分子生物学中的标准模式生物——来规避这些瓶颈，使其承载源自噬菌体T7的第二套人工DNA复制系统，该病毒感染细菌并因其简单高效的复制系统而被广泛研究。T7-ORACLE实现了生物大分子的连续超突变和加速进化，其设计旨在广泛适用于多种蛋白质靶点和生物学挑战。从概念上讲，T7-ORACLE基于并扩展了现有正交复制系统的工作——这意味着它们独立于细胞自身的机制运作——例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，面包酵母）中的OrthoRep和大肠杆菌中的EcORep。与这些系统相比，T7-ORACLE的优势在于结合了高诱变率、快速生长、高转化效率，以及大肠杆菌宿主和环状复制子质粒都能轻松整合到标准的分子生物学工作流程中。

T7-ORACLE正交系统仅靶向质粒DNA（小的环状遗传物质片段），不触及细胞的宿主基因组。通过将T7 DNA聚合酶（一种复制DNA的病毒酶）改造为易错型，研究人员以比正常高10万倍的速率向目标基因引入突变，且不损伤宿主细胞。

“该系统代表了连续进化领域的重大进步，”共同资深作者、斯克里普斯研究所化学助理教授克里斯蒂安·迪尔克斯（Christian Diercks）表示。“现在不再是每周进行一轮进化，而是每次细胞分裂时就能完成一轮——这确实极大地加速了进程。”

为展示T7-ORACLE的能力，研究团队将一种常见的抗生素抗性基因TEM-1 β-内酰胺酶插入该系统，并将大肠杆菌细胞暴露于剂量递增的不同抗生素中。不到一周，该系统就进化出了能够抵抗比原始浓度高出5000倍的抗生素水平的酶变体。这一概念验证不仅证明了T7-ORACLE的速度和精确性，还通过模拟抗生素作用下耐药性产生的过程，展示了其实际应用价值。

“令人惊讶的是，我们观察到的突变与临床环境中发现的实际耐药性突变高度吻合，”迪尔克斯指出。“在某些情况下，我们发现了新的组合，其效果甚至优于临床中常见的组合。”

但迪尔克斯强调，该研究的重点并非抗生素耐药性本身。

“这不是一篇关于TEM-1 β-内酰胺酶的论文，”他解释道。“该基因只是一个经过充分表征的基准，用以展示系统如何运作。重要的是，我们现在能够在几天而非数月内进化几乎任何蛋白质，例如癌症药物靶点和治疗性酶。”

T7-ORACLE更广泛的潜力在于其作为蛋白质工程平台的适应性。虽然该系统构建在大肠杆菌中，但该细菌主要充当连续进化的载体。科学家可以将来自人类、病毒或其他来源的基因插入质粒，然后将质粒导入大肠杆菌细胞。T7-ORACLE会突变这些基因，产生可筛选或选择以获取改进功能的变异蛋白质。由于大肠杆菌易于培养且在实验室中广泛使用，它为进化几乎任何目标蛋白质提供了一个便捷、可扩展的系统。

这可能帮助科学家更快地进化抗体以靶向特定癌症，进化更有效的治疗性酶，并设计靶向参与癌症和神经退行性疾病蛋白质的蛋白酶。

“令人兴奋的是，它不局限于一种疾病或一类蛋白质，”迪尔克斯说。“因为该系统是可定制的，你可以放入任何基因，并根据需要的功能对其进行进化。”

此外，T7-ORACLE与标准的大肠杆菌培养物和广泛使用的实验室工作流程兼容，避免了其他连续进化系统所需的复杂操作流程。

“使其与众不同的主要特点是实施的简易性，”迪尔克斯补充道。“不需要专门的设备或专业知识。如果你已经熟悉大肠杆菌操作，只需极少调整就很可能使用此系统。”

T7-ORACLE体现了舒尔茨更宏大的目标：重建关键的生物过程——如DNA复制、RNA转录和蛋白质翻译——使其独立于宿主细胞运作。这种分离使科学家能够重新编程这些过程而不干扰正常的细胞活动。通过将基本过程与基因组解耦，像T7-ORACLE这样的工具有助于推动合成生物学的发展。

“未来，我们有兴趣利用此系统进化能够复制完全非天然核酸的聚合酶：即类似于DNA和RNA但具有新颖化学性质的合成分子，”迪尔克斯说。“这将为我们刚刚开始探索的合成基因组学领域开辟可能性。”

目前，研究团队专注于进化用于治疗的人类来源酶，以及定制蛋白酶以识别特定的癌症相关蛋白质序列。

“T7-ORACLE方法融合了两者的优势，”舒尔茨说。“我们现在可以将合理的蛋白质设计与连续进化相结合，以前所未有的效率发现功能分子。”

除迪尔克斯和舒尔茨外，研究《用于大肠杆菌中连续超突变和加速进化的正交T7复制体 (An orthogonal T7 replisome for continuous hypermutation and accelerated evolution in E. coli)》的作者还包括斯克里普斯研究所的Philipp Sondermann、Cynthia Rong、Thomas G. Gillis、Yahui Ban、Celine Wang和David A. Dik。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（资助号 RGM145323A）的资助。