活宿主的全基因组筛查揭示了寄生虫感染的新秘密

顶复门寄生虫是一种常见的疾病，每年感染数亿人。他们是传播疟疾的罪魁祸首；隐孢子虫病——一种严重的儿童腹泻病；弓形虫病——一种危及免疫力受损的人和胎儿的疾病，也是孕妇被告知避免更换猫砂的原因

顶复门寄生虫非常善于感染人类和许多其他动物，并在它们体内持续存在。研究人员对顶复合体如何感染宿主了解得越多，就越能开发出针对寄生虫的有效治疗方法

为此，由研究生Christopher Giuliano领导的怀特海研究所成员Sebastian Lourido实验室的研究人员现在完成了对感染小鼠期间引起弓形虫病的顶复体寄生虫弓形虫（T.gondii）的全基因组筛查。这个屏幕显示了每个基因对寄生虫感染宿主的能力有多重要，为基因的功能提供了线索

在7月8日发表在《自然微生物学》杂志上的文章中，研究人员分享了他们追踪活宿主中寄生虫谱系的方法，以及一些令人感兴趣的具体发现，包括可能的抗寄生虫药物靶点

从培养皿到动物

Lourido实验室的研究人员此前在2016年开发了一种筛查方法，用于测试培养皿中细胞中每个弓形虫基因的功能。他们使用CRISPR基因编辑技术制造突变寄生虫，其中每个谱系都有一个基因失活

然后，研究人员可以根据缺失该基因的突变体的表现，评估每个基因对寄生虫健康或茁壮成长能力的重要性。如果突变体死亡，这意味着其失活基因对寄生虫的生存至关重要

这一屏幕让研究人员了解了很多关于弓形虫生物学的知识，但面临着一个共同的局限性：寄生虫是在培养皿中而不是活宿主中研究的。细胞培养提供了一种更容易研究寄生虫的方法，但条件与寄生虫在动物宿主中面临的条件不同。宿主的身体是一个更复杂和动态的环境，因此可能需要寄生虫依赖于它们在细胞培养的人工环境中不需要的基因

为了克服这一局限性，Lourido实验室的研究人员想出了如何在活体小鼠中重复弓形虫全基因组筛查的方法，他们的实验室同事以前在细胞培养中做过这项工作。这是一项艰巨的任务，需要解决各种技术挑战并进行大量并行实验

弓形虫有大约8000个基因，因此研究人员进行了混合实验，每只小鼠都感染了许多不同的突变体，但不会感染到小鼠。这意味着研究人员需要一种方法来更密切地监测小鼠中突变体的轨迹

他们需要追踪携带相同突变的寄生虫谱系，因为这将使他们能够看到特定突变体的不同复制谱系是如何表现的

研究人员在CRISPR工具中添加了条形码，使寄生虫中的一个感兴趣的基因失活。当他们收获寄生虫的后代时，条形码将识别谱系，区分以相同方式突变的复制寄生虫

这使得研究人员能够使用基于人群的分析方法来排除错误结果并减少实验噪声。然后，他们可以得出关于每个谱系表现如何的结论。谱系追踪使他们能够绘制不同种群的寄生虫在宿主体内的传播方式，以及某些种群在一个器官中的生长是否比另一个器官更好

研究人员发现，与细胞培养相比，237个基因对寄生虫在活宿主中的适应性有更大的贡献。其中许多以前并不知道对寄生虫的健康很重要。当前筛选中鉴定的基因在寄生虫的不同部位都很活跃，并影响其与宿主相互作用的各个方面

研究人员还发现，当基因失活时，活宿主中的寄生虫适应度会增加；例如，这些基因可能与宿主免疫系统用来检测寄生虫的信号有关。接下来，研究人员对几个特别感兴趣的健身改善基因进行了随访

在活宿主中起作用的基因

一个突出的基因是GTP环水解酶I（GCH），它编码一种参与必需营养叶酸生产的酶。Apicomplexans依赖叶酸，因此研究人员想了解GCH在为寄生虫保护叶酸方面的作用

细胞培养基含有高水平的叶酸，在这种营养丰富的环境中，GCH不是必需的。然而，在活小鼠中，寄生虫必须清除叶酸并使用含有GCH的代谢途径合成叶酸。Lourido和Giuliano揭示了该途径如何运作的新细节

尽管之前GCH的作用尚未完全清楚，但叶酸对顶复合体的重要性是一个众所周知的弱点，已被用于设计抗寄生虫疗法。抗叶酸药物乙胺嘧啶通常用于治疗疟疾，但许多寄生虫已经对其产生了耐药性。

一些耐药的顶复体增加了它们所拥有的GCH基因拷贝数，这表明它们可能正在使用GCH介导的叶酸合成来克服乙胺嘧啶。研究人员发现，将GCH抑制剂与乙胺嘧啶联合使用可以提高药物对寄生虫的疗效

GCH抑制剂本身也有效。不幸的是，目前可用的GCH抑制剂靶向哺乳动物和寄生虫的叶酸途径，因此在动物中使用是不安全的。Giuliano及其同事正在开发一种寄生虫特异性的GCH抑制剂，作为一种可能的治疗方法

Giuliano说：“叶酸代谢途径的一半以前看起来对寄生虫不重要，只是因为人们在细胞培养基中添加了太多的叶酸。”。“这是细胞培养实验中可能遗漏的一个很好的例子，特别令人兴奋的是，这一发现使我们找到了一种新的候选药物。”

另一个感兴趣的基因是RASP1。研究人员确定，RASP1不参与最初的感染尝试，但如果寄生虫失败并需要进行第二次尝试，则需要RASP1

他们发现RASP1需要重新加载寄生虫的一种称为棒状体的细胞器，寄生虫利用这种细胞器来破坏和重新编程宿主细胞。没有RASP1，寄生虫只能部署一组棒状体，因此只能尝试一次入侵

确定RASP1在感染中的作用也表明了研究寄生虫如何与不同细胞类型相互作用的重要性。在细胞培养中，研究人员通常在成纤维细胞（一种结缔组织细胞）中培养寄生虫

研究人员发现，寄生虫可以在有或没有RASP1的情况下侵入成纤维细胞，这表明这种细胞类型很容易被它们侵入。然而，当寄生虫试图入侵巨噬细胞（一种免疫细胞）时，没有RASP1的巨噬细胞通常会失败，这表明巨噬细胞给寄生虫带来了更多的挑战，需要多次尝试

该屏幕揭示了其他可能的细胞类型特异性途径，这些途径仅使用培养皿中的模型细胞类型是无法发现的

屏幕还突出显示了一个以前未命名的基因，研究人员称之为GRA72。先前的研究表明，该基因在寄生虫自身周围形成的液泡或保护膜中起着重要作用。Lourido实验室的研究人员证实了这一点，并发现了GRA72缺失如何破坏寄生虫液泡的更多细节

Lourido、Giuliano及其同事希望他们的发现能为寄生虫生物学提供新的见解，特别是在GCH的情况下，能够带来新的治疗方法。他们打算继续从结果的宝库中挖掘——他们的筛选确定了许多其他感兴趣的基因，这些基因需要后续研究，以了解更多关于顶复门寄生虫及其与哺乳动物宿主的相互作用

Lourido说，他实验室的其他研究人员已经使用筛查结果来指导他们在自己的项目中找到相关的基因和途径

“这是一个杰出的资源，”Lourido说，他也是麻省理工学院的生物学副教授。“筛查结果揭示了寄生虫与宿主相互作用的更广泛方式，并丰富了我们对寄生虫能力和脆弱性的感知。”