对荧光“暗态”的新见解阐明了改进成像的前进方向

圣犹达儿童研究医院的科学家报告了一种使用单分子荧光共振能量转移（smFRET）改进分子尺度距离测量的方法。smFRET量化了被称为荧光团的化学物质的激发和发射特性。研究结果发表在《自然方法》杂志上

当荧光团中的激发电子弛豫时，它会在延迟后发光，导致分子发光（发出荧光）。然而，荧光团在激发后并不总是发出荧光。相反，通过与激发电子的“自旋”态相关的量子力学过程，它们可以进入不发荧光的长寿命三重态暗态

这降低了smFRET测量的灵敏度和准确性。通过“自我修复”技术控制暗态的持续时间，圣犹达的科学家现在表明，三重态暗态可以得到有力的缓解

这一进步显著提高了该方法的分辨率，从而推进了分子成像领域

smFRET捕捉稍纵即逝的分子瞬间

捕捉蜂鸟翅膀的拍打需要具有高帧率和照明的专用相机，以避免快速运动的模糊。与捕捉我们体内生物分子功能的挑战相比，想象蜂鸟的飞行相形见绌

生物分子比光的波长小（大约十亿分之一英寸），它们的功能与运动有关，每秒改变数百到数千次位置或形状（构象）

测量这些短暂的动力学对于真正了解分子如何发挥其功能、这些功能在疾病中如何受到干扰以及药物疗法如何改变其活性至关重要。smFRET是一种分子成像技术，它是一种在单分子尺度上直接可视化生物分子如何实时移动的强大方法

在圣犹达，结构生物学系、化学生物学与治疗学系的Scott Blanchard博士正在推进smFRET成像领域。布兰查德实验室通过圣犹达单分子成像中心所做的努力，对设计和开发能够在分子尺度上进行测量的荧光团至关重要

Blanchard说：“最常见和最广泛使用的荧光分子通常无法在分子尺度上量化事件。这导致我们面临合成自己的荧光团的挑战。”。“在这样做的过程中，我们意识到荧光的基本光物理需要改变。”

为了进行smFRET实验，研究人员将荧光团放置在生物分子的两个点上。当激光指向这些荧光团中的第一个（供体）时，其中的电子获得能量，并被激发

当电子弛豫时，这种能量通过空间转移到第二荧光团（受体），但前提是它靠近供体。通过记录和量化来自供体和受体荧光团的荧光爆发，可以测量大约十亿分之一英寸的距离

每一条信息对于理解生物功能和故障至关重要。然而，正确使用该技术需要仔细导航荧光的基本特性

电子自旋翻转锁定在三重态

控制荧光团发光的规则围绕着电子自旋。当激发的电子弛豫时，它应该回到原来的状态，保持其自旋状态或自旋量子数。然而，这种情况并不总是发生

《自然方法》研究的通讯作者Blanchard说：“每次电子被激发时，它都有可能失去对自旋的记忆，并采用反向自旋状态。”

“虽然这一过程相对罕见，概率约为1/100，但如果它确实改变了自旋状态，那么它最终会处于寿命延长100000倍的三重态，不会发出荧光。因此，荧光团会变得比其他情况下暗得多。

”Blanchard补充道：“多年来，荧光领域一直在与此作斗争。在FRET的背景下，我们注意到三重态的积累会随着光照强度的变化而变化，并因不同的荧光团而异。”。“

FRET需要供体和受体荧光团以相同的方式工作。但是，由于该技术需要直接激发其中一个，而不是另一个，当你打开激光时，供体和受体的三重态以不同的速率被占据。

”你最终会遇到一个令人恶心的过程，供体和接收器在不同的水平上保持稳定，因此它们在不同程度上失去了性能，”Blanchard解释道。“实验读数会发生变化，导致成像数据的质量和可靠性降低。”。这从根本上限制了smFRET测量的空间和时间分辨率限制。“因此，荧光团工程研究的一个关键目标是尽可能缩短三重态的寿命。这是‘自我修复’技术的基本目标。

”为了确保smFRET数据中的精确距离测量，该领域目前依赖于没有明确考虑三重态状态的校准步骤，”第一作者之一、圣犹达结构生物学系的Zeliha Kilic博士解释道。“

自愈性荧光团指导了被称为三重态猝灭剂的化学物质，如环辛四烯，抵消了这一现象，但也往往会使工作变得胶着。”Blanchard说：“环辛四烯油腻，表现出不同的低溶解度，很难控制。”smFRET实验中的供体和受体提高了数据质量和可靠性，并防止了随着激光强度的增加成像质量的损失。这些改进推动了smFRET的前沿发展，自修复荧光团技术在全球范围内的应用越来越多样化。

”自修复荧光团增强的亮度和光稳定性使其有可能显著提高smFRET成像的时空分辨率，”第一作者之一Avik Pati博士说，他曾在圣犹达结构生物学系工作，现在在Birla技术与科学研究所工作。

“我们现在可以在亚毫秒和生理氧浓度下稳健地量化单个生物分子内的纳米级构象动力学。“

Blanchard相信这些发现将有助于圣犹达的研究人员和更广泛的科学界。”他说：“推动圣犹达成像创新的前沿是该机构战略计划的一部分，我们相信自修复荧光团将在实现我们的目标方面发挥重要作用。”

“此外，许多人可能会从这些进步中受益，因为自修复方法已显示出改善大多数荧光应用的潜力。”。p