NanoCas是用单个AAV测试的CRISPR的较小版本，可提供靶向结果

Mammoth Biosciences的研究人员开发了NanoCas，这是一种超紧凑的CRISPR核酸酶，证明了它能够使用单个腺相关病毒（AAV）载体在包括骨骼肌在内的非肝组织中进行基因编辑。在非人灵长类动物（NHP）中的实验导致肌肉组织的编辑效率超过30%

CRISPR基因编辑已经彻底改变了遗传学，但递送挑战将其临床应用主要限制在离体和肝脏导向疗法上。传统的CRISPR核酸酶，包括Cas9和Cas12a，超过了单个AAV载体的包装极限，因此需要双重AAV策略来降低效率

已经发现了较小的CRISPR系统，如Cas12i和CasX，但它们仍然太大或编辑效率低。现有的紧凑型系统，如Cas14和IscB，在大型动物模型中没有表现出强大的功效

在bioRxiv预印本服务器上发表的“使用超紧凑核酸酶NanoCas对非人类灵长类动物骨骼肌进行单次AAV CRISPR编辑”研究中，研究人员进行了全面的宏基因组筛选，分析了21980个宏基因组，以鉴定超紧凑CRISPR系统

研究人员选择了600个氨基酸下的176个候选核酸酶，通过计算RNA结构预测、PAM序列鉴定和哺乳动物细胞染色体编辑分析对其进行评估

最有效的候选者被称为NanoCas，通过蛋白质工程进一步优化。在220位（D220R）有精氨酸取代的变体提高了DNA结合和编辑效率。在人胚胎肾细胞（HEK293T）、T细胞和CD34+造血干细胞和祖细胞中评估编辑性能

在体内测试中，NanoCas通过AAV8在小鼠体内靶向胆固醇调节基因Pcsk9，在肝脏中实现了约60%的编辑效率，并降低了血清Pcsk9水平。其他研究针对肌营养不良蛋白中的外显子剪接位点，以研究杜氏肌营养不良症的潜在应用

非人灵长类实验使用AAV9-4A进行肌肉递送。食蟹猴接受全身性AAV9 NanoCas注射，在治疗后4周和8周进行骨骼肌活检，并在治疗后12周分析其他组织

人类细胞系中NanoCas的编辑效率平均为20%，60%的受试引导RNA达到了可检测的活性。D220R变体提高了不同组织的编辑效率。在体内，NanoCas介导的小鼠Pcsk9编辑导致60%的indel频率，与SaCas9相匹配，同时受益于较小的基因有效载荷

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种由基因突变引起的衰弱性肌肉无力疾病，是潜在基因编辑疗法的高价值靶点。在人源化小鼠模型中进行的DMD靶向实验表明，在股四头肌、小腿和心脏组织中进行了10-40%的编辑

在非人类灵长类动物中，NanoCas在骨骼肌中实现了高达30%的编辑，并且随着时间的推移，编辑水平逐渐提高。心脏编辑达到15%，肝脏脱靶编辑仍低于2%

NanoCas是第一个在非人类灵长类动物中证明有效体内肌肉编辑的AAV CRISPR系统。这种紧凑型核酸酶的影响是广泛的，能够实现更广泛的组织靶向、更有效的基因治疗和精确编辑应用，包括在碱基编辑和表观遗传修饰中的应用 More information: Benjamin J. Rauch et al, Single-AAV CRISPR editing of skeletal muscle in non-human primates with NanoCas, an ultracompact nuclease, bioRxiv (2025). DOI: 10.1101/2025.01.29.635576

Journal information: bioRxiv